|
|
Tampão fosfato (PBS) 0,2 M (pH 7,4): |
|
- Fosfato de
sódio monobásico (NaH2PO4).. |
5,2 g |
|
- Fosfato de
sódio dibásico (Na2HPO4)........ |
23 g |
|
- H2Odd....................................................... |
1000 mL |
|
- Volume
total................................................ |
1000 mL |
|
Tampão Millonig 0,12 M (pH 7,4):
(guardar a 4°C)
|
|
- Hidróxido
de sódio (NaOH)......................... |
3,88 g |
|
- Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4)... |
16,56 g |
|
- Cloreto de cálcio (CaCl2)............................. |
0,02 g |
|
- H2Odd......................................................... |
985 mL |
|
- Volume
total................................................. |
1000 mL |
|
2)
Soluções
a serem preparadas no momento do experimento: |
|
Glutaraldeído 3% (pH 7,4): |
Usar
150mL por animal (calcular 10mL de sobra para banhar cada cérebro em
sacarose 30%).
|
- Glutaraldeído............................................ |
36 mL |
|
- Tampão
fosfato 0,2 M.............................. |
150 mL |
|
- H2Odd.................................................... |
144 mL |
|
- Volume
total............................................ |
300 mL |
|
Fixador Sulfeto de Sódio 0,1% ( PH 7,4) |
Usar 250mL
por animal. Prepare o sulfeto de sódio em um Elenmayer. Fechar o vidro
adequadamente enquanto agita. Trabalhar na capela, além de tóxico, o
cheiro é horroroso!
|
- Tampão
Millonig 0,12 M........................... |
1000 mL |
|
- Sulfeto
de sódio........................................ |
1 g |
|
- Volume
total............................................. |
1000 mL |
Perfundir na seguinte ordem:
|
-- Tampão
Millonig ............................... |
25 mL |
só lavar |
|
-- Solução
de sulfeto de sódio................ |
50 mL |
3 minutos |
|
-- Glutaraldeído.................................... |
100 mL |
7 minutos |
|
-- Solução
de sulfeto de sódio............... |
200 mL |
17 minutos |
|
::
PROCESSAMENTO DO TECIDO :: |
|
|
Dissolva 500g de goma arábica em pó em 1 litro de água destilada.
Coloque no agitador a 40ºC
e mexa constantemente com uma espátula para acelerar a dissolução.
Congele em potes de 120mL (validade de 6 meses). No dia do processamento
descongele apenas a quantidade que pretende usar (120mL cobre 1 carrinho
contendo lâminas).
Misture
0,51g de nitrato de prata com 3mL de água destilada. O nitrato de prata
é sensível à luz. Após dissolvido, pode ser guardado a 4°C, em
ambiente escuro por até uma semana.
|
Solução A
(total 40mL) |
|
Solução B (total 60 mL) |
|
|
-10,25g
ácido cítrico |
- 3,73g
hidroquinona |
|
- 9,45g
citrato de sódio |
- 60mL água
destilada |
|
- 30mL água
destilada |
|
--> Corte o encéfalo em fatias de
30 a 40 µm,
monte as lâminas e deixe secar. Coloque as lâminas em dois "carrinhos"
dentro de balsas de vidro. Não coloque nada de metal para não
atrapalhar a reação.
--> Em um
recipiente (360 mL) misture: 240 mL de goma arábica
Solução
A
Solução
B
--> Coloque
as balsas em uma bandeja com água fria (18ºC).
Em uma
câmara escura acrescente 2mL do nitrato de prata e misture
bem mexendo com uma espátula de plástico. Despeje a solução nas balsas
até que cubra as lâminas. Mantenha no escuro por 30 a 60 min. Depois retire
do escuro e interrompa a reação lavando com água destilada por 10min.
Em seguida desidrate em concentrações crecentes de etanol , passe no
xilol e cubra com bálsamo do Canadá (não usar Entelan pois reage com
a prata).
|
