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Perfusão: (para cada rato) |
- 400
ml/Kg
de tampão fosfato (PB, 0.1 M , pH
7.4)
- 800 ml/Kg de paraformaldeído (4°C) em PB 0.1 M
(algumas pessoas preferem passar 0,2ml de heparina antes do PB,
para limpeza total
dos vasos)
Após a perfusão os cérebros serão
colocados em 30% de sacarose em tampão fosfato (PB), por 18-24h, para
crioproteção. Posteriormente os encéfalos serão fatiados no criostato
com espessura de 32 micrometros. Os cortes que não serão utilizados para
imuno-histoquímica poderão ser guardados em solução anti-freezer.
1 – Lavar, no agitador, com tampão fosfato (PB) 0,1M, pH = 7,2 (3 x 10min.)
· 1000 mL de água destilada
· 3,18g de NaH2PO4
(monobásico)
· 10,94g de Na2HPO4
(dibásico)
2 – Lavar, no
agitador, com H2O2 , 10min
· 400µl
de água oxigenada (H2O2) de 30 vol.
· 40mL de água destilada
Obs.: Usado para bloquear a peroxidase endógena do tecido
3 – Lavar, no agitador, com tampão fosfato (PB)
0,1M, pH = 7,2 (1 x 5min.)
4 – Incubar,
no agitador, em blocking buffer (BB) , por 30min
· 90ml de
PB 0,1M
· 250ml de Triton (detergente especial)
· 450ml de soro normal de cabra
5 – Incubar,
agitando, em anticorpo primário em BB , por 2h ou over night
Obs.: É necessário fazer
titulações do anticorpo (c-fos ou qualquer um outro) para verificar a
melhor concentração a ser utilizada.
6 – Lavar, no
agitador, com PB, 5 x 5min.
7 – Incubar,
agitando, em anticorpo secundário em BB , por 2h
Obs.:Anticorpo
biotinilado, geralmente usado na concentração de 1:200
Preparar
o Kit ABC
10min. antes
de terminar
às 2h, pois, esta solução
deve ser preparada 30min. antes
de ser
utilizada, no mínimo.
8 – Lavar com
PB , 3 x 10min.
9 – Incubar
no kit ABC standard , 1h30min.
·
0,69g
de NaCl
· 90ml
de Triton
· 30ml de PB 0,1M
·
5 gotas
de A
·
5 gotas
de B
Obs.: Não colocar
o NaCl quando usar
o Kit Elite
10 – Lavar
com PB , 1 x 10min.
11 – Lavar, no agitador, em tampão acetato
de sódio 0,1M, por 2 x 10min.
13,62g de acetato
de sódio
1L de água
pH = 6,0
12 – Diaminobenzidina (DAB), feito dentro
da capela
– usar proteção para nariz
e mãos
1 - 60 mg de beta
D-glicose
2 - 12 mg de cloreto
de amônia
3 - 0,45 mg de glicose
oxidase
4 - 15 mg de DAB
5 - 15
mL de solução de sulfato
de amônio e níquel
15 mL de KPBS a 0,02M (OU
6 mL de KPBS a 0,05M + 9 mL de H2Od). Com
essa solução diluir 1 , 2 e 4 em Eppendorfs
separadamente.
Colocar o 1
e o 2
na solução
Colocar o 5
Dissolver
o 3 com
essa nova mistura
de solução
Acrescentar
o 4,
e por último o 3.
Banhar
os cortes com
essa mistura, controlar
o tempo pela cor
dos cortes
(±
5min.) que deve ficar em tons claros de marcação.
OBS.: Embora
saibamos que o DAB não é totalmente inativado pela água sanitária,
colocamos água
sanitária
na mesma quantidade do dab (30mL) para precipitá-lo. Alguns
pesquisadores recomendam também deixar o DAB exposto a luz para
inativá-lo.
Ou ainda usar permaganatos. Em qualquer caso é sempre recomendado a
leitura da bula do kit de reação do DAB para verificar qual a melhor
forma de descartá-lo sem poluir o meio ambiente.
13 – Lavar com tampão acetato muitas vezes , por 3
x 10min.
14 – Lavar com
PB, por 6 x 10min.
15 – Montar os cortes em lâminas gelatinadas e esperar secar totalmente
16 – Desidratar os cortes em concentrações
crescentes de etanol até o xilol:
70% / 96% / 100% / 100% / Xilol / Xilol
17 – Fechar as lâminas com
lamínulas utilizando o Entelan ou DPX. |
