Mapa do Site

Correio UNIFESP

Sobre o Site

Home

Sobre o Laboratório

 Equipe

 Linhas de Pesquisa

 Publicações (pdf)

 Teses/ Dissertações

 Técnicas Experimentais

                 ( DICAS)

 Imuno (ilustrações)

 Cientistas e Descobertas

 Neurociência no Brasil

 Auxílios Financeiros

 Links Neurociências

 Materiais Didáticos

(Aulas/tutoriais/Protocolos)

 Curso de Verão

 Proteção aos Animais

 Informações

       Comunitárias

  Email

pay per click advertising Counter

    ٠٠٠  Visão Geral   ٠٠٠    

Por Gabriela Filoso Barnabé

          As células-tronco podem ser definidas como células indiferenciadas capazes de auto-renovação e de se diferenciar originando progenitores maduros, compreendendo tanto progenitores que não se renovam quanto células efetoras completamente diferenciadas. É importante restringir esta definição a células únicas que, uma vez desenvolvidas, se auto-renovam por toda a vida de um organismo, a fim de distinguir as células-tronco dos muitos tipos de células progenitoras (com auto-renovação limitada). Assim, funcionalmente, as células-tronco são células multipotentes localizadas no topo da hierarquia das linhagens.

    Até pouco tempo acreditava-se que apenas as células-tronco embrionárias eram capazes de se diferenciar em células de origem ectodérmica, endodérmica e mesodérmica. Em 1999, vários estudos surpreenderam os cientistas mostrando que as células-tronco de um tecido, como o encéfalo, poderiam se transformar em outras, como células sanguíneas. Esses estudos revelam o poder inesperado das células-tronco de adultos.

    A classificação das células-tronco tem sido feita com base no seu potencial de desenvolvimento. São chamadas de totipotentes as células capazes de gerar todos os tipos celulares embrionários e extra-embrionários, pluripotentes as que podem originar todas as células que formam um embrião (propriamente dito), multipotentes quando originam um subgrupo de linhagens celulares, oligopotentes são capazes de gerar células mais restritas a uma linhagem do que as multipotentes e, por final, as unipotentes podem contribuir originando apenas um único tipo celular maduro (Wagers and Weissman, 2004).

    As células-tronco, por poderem, teoricamente, ser induzidas a se diferenciar em qualquer tipo celular do corpo, revelam possibilidades nunca antes imaginadas, como tecidos originados em laboratório e até substituição de órgãos e células para tratar uma gama de distúrbios humanos.

    Segundo Verfaillie, (Science, 2000), além das fronteiras resultantes dos dilemas éticos ao redor de pesquisas usando células-tronco embrionárias e fetais, as células provenientes de adultos possuem uma vantagem adicional: elas são mais fáceis de manipular. As células-tronco embrionárias tendem a se diferenciar espontaneamente em todos os tipos de tecidos. Quando injetadas sob a pele de um camundongo imunossuprimido, por exemplo, elas podem crescer dando origem a teratomas. Ao contrário, as células-tronco de adultos não se diferenciam espontaneamente, mas podem ser induzidas por meio da administração de fatores de crescimento apropriados ou outros sinais externos. Os fatores mitogênicos necessários para a indução da proliferação dessas células ainda não são completamente conhecidos.

    No entanto, as células-tronco adultas parecem ter uma desvantagem no que se refere à perda de sua capacidade de se dividir e se diferenciar após um certo tempo em cultura, o que as torna inadequadas para algumas aplicações terapêuticas. Já as células-tronco embrionárias parecem ter capacidade infinita de se dividir e não perdem sua potencialidade.

    O grande interesse em estudar as células-tronco vem da sua capacidade em originar diversos tipos celulares que constituem o corpo e talvez forneçam substituições para tecidos lesados pela idade, por trauma ou doença. Sendo assim, as células-tronco possuem uma gama de aplicações em terapias para diversas doenças consideradas até então incuráveis e outras para as quais não há tratamento farmacológico eficaz. Dentre essas doenças pode-se destacar as doenças neurodegenerativas como Parkinson, Alzheimer, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, retinopatias e muitas outras como diabetes tipo II, acidentes vasculares (incluindo AVC), cardiopatias e câncer.

    Os resultados obtidos até o momento com terapias celulares utilizando as células-tronco têm sido animadores. Já existem estudos em andamento na fase clínica que revelam perspectivas nunca antes imaginadas, dando esperança para os pacientes. Apesar da aparente promessa de serem capazes de curar todo tipo de doença, o conhecimento científico por trás das aplicações terapêuticas das células-tronco deve estar bastante sólido antes de ser utilizado pela comunidade médica.

     ٠٠٠   Obtenção e Cultivo das Células-tronco    ٠٠٠

(voltar)

        1 - Obtenção e cultivo das células-tronco mesenquimais de medula óssea

        As amostras de medula óssea são obtidas a partir de fêmures de ratos adultos (250 g) da linhagem Wistar. Para cada período de cultivo (cultura nova e antiga) foi utilizado um rato. Os animais são sacrificados por overdose de anestésico (tiopental sódico - Cristália; 3,5 mL/animal ) e têm os dois fêmures dissecados, eliminando os tecidos muscular e conjuntivo associados. Em seguida são feitos dois cortes na região das epífises, removendo-as, possibilitando a entrada da agulha na cavidade medular, onde são injetados 10 mL de DMEM (Dulbeco´s Modified Eagle Medium - GibcoBRL) sem soro.

        O material obtido é ressuspenso e centrifugado a 1.500 rpm durante 10 minutos. O pellet é ressuspenso em DMEM sem soro, num volume de cerca de 4 mL e transferido para um outro tubo de 15 mL contendo 4 mL de Ficoll-Paque (densidade 1.077 g/mL - Amersham Biosciences) (diluição Ficoll:meio de 1:1), evitando que as duas fases líquidas se misturem. Centrifuga-se a 2.000 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, coleta-se o anel de células na interface Ficoll-células e as ressuspende em solução BSS respeitando a diluição 1:5 (células:BSS). Centrifuga-se novamente a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezando o sobrenadante. Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes a fim de retirar o excesso de Ficoll, que é tóxico para as células.

Após a última lavagem, o pellet é ressuspenso em 1 mL de DMEM com 20% de soro fetal bovino (SFB – StemCell Technology) e então as células são contadas, utilizando Trypan Blue (GibcoBRL) para acessar a viabilidade das células extraídas. Por final as células são plaqueadas em frascos canted neck com filtro (Corning), de 25 cm², com 5 mL de meio de cultura composto por DMEM 20% SFB acrescido de 1% de penicilina e estreptomicina (StemCell Technology) e de 4% de L-glutamina (GibcoBRL).

São plaqueadas 1x10⁶ células na cultura mais antiga e 3x10⁶ células na cultura considerada nova. As células foram mantidas em estufa a 37 ^oC em 5% de CO₂ e umidade de 95%. O meio de cultura é trocado a cada 3 ou 4 dias, retirando-se 4 mL do meio acondicionado e substituindo-se por 4 mL de meio fresco.

Quando as células em cultivo alcançavam confluência de aproximadamente 80%, era feita a passagem. Removendo o meio de cultura do frasco, as células mesenquimais aderentes permanecem aderidas ao frasco. Essas células devem ser lavadas com DMEM sem soro para remover o SFB residual e depois incubadas com 1 mL de tripsina e EDTA (StemCell Technology), a 37 ºC até se destacarem (cerca de 4 minutos). Às células já soltas, adiciona-se meio de cultura com 20% de SFB para neutralizar a ação da tripsina. As células são centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, então o sobrenadante é removido e o pellet é ressuspenso em meio de cultura completo (DMEM + 20% SFB). Essas células podem agora ser divididas em novos frascos de 25 cm² para cultura. A cultura de células antiga sofreu 4 passagens, sendo que na primeira a concentração foi de 1:4, na segunda, terceira e quarta passagens foi de 1:10. Já a cultura nova permaneceu na passagem 0 até a realização dos experimentos.

          Indução de diferenciação - O protocolo de indução da diferenciação das células-tronco mesenquimais em células neurais consiste nas seguintes etapas:

         Pré-indução: o meio de cultura é substituído pelo meio pré-indutor, composto por DMEM / 20% SFB e 1 mM de b-mercaptoetanol (Sigma), sendo as células incubadas nessa solução durante 24h.

        Indução: posteriormente recebem tratamento com os indutores neurais butil-hidroxi-anizol (BHA / butylated hydroxyanisole - Sigma) (200 mM) e dimetil-sulfóxido (DMSO - Sigma) (2%) em DMEM. A solução de BHA deve ser feita em álcool 70%.  Para posterior realização da imunocitoquímica foram adotados dois intervalos de tempo para a indução neural: 24 e 72 horas, após os quais as células são fixadas.

          2 - Obtenção e cultivo das células-tronco neurais

    As células-tronco neurais são obtidas a partir de encéfalo de embrião E14 e da zona subventricular (SVZ) de adulto, ambos de camundongos da linhagem balb/c. Os animais utilizados são sacrificados por deslocamento cervical.

    Tanto os embriões de camundongo E14 quanto o encéfalo de camundongo adulto são depositados em uma placa de Petri contendo PBS com 2% de glicose. A dissecção é feita em uma lupa e o material obtido é transferido para um tubo adicionando-se em seguida 5 mL do meio de cultura suplementado. A seguir o tecido é triturado passando pela pipeta com ponteira de 1.000 mL seguido pela ponteira de 200 mL, até obter-se uma suspensão de células únicas. As células obtidas são quantificadas e a viabilidade avaliada usando Trypan Blue (GibcoBRL).

    As células são plaqueadas em frascos T-25 canted neck (Corning) na densidade de 2x10⁵ células por mL em 10 mL de meio de cultura completo. O meio de cultura para as células tronco neurais é composto por 10% de NeuroCult^TM NSC Proliferation Supplements (StemCell Technology) e 90% de NeuroCult^TM NSC Basal Medium (StemCell Technologies), específicos para murinos. Além disso também deve ser adicionado hEGF (20 ng/mL), FGF-2 (20 ng/mL) e heparina (5 mg/mL). As neuroesferas são centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos e metade do meio de cultura de cada frasco é trocado a cada 3 ou 4 dias, substituindo por meio de cultura fresco. As neuroesferas formadas são mantidas numa estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior que 95%) e da proporção de CO₂  (5%) no ar.

        Indução de diferenciação - Primeiramente as neuroesferas devem ser dissociadas mecanicamente – passando-se pelas ponteiras de 1.000 mL e de 200 mL – e plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-lisina e laminina, que promovem a adesão das células. Após terem aderido, permanecem em poços (Multiwell de 12) contendo 1 mL de meio de cultura composto por NeuroCult^TM NSC Basal Medium, NeuroCult^TM NSC Proliferation Supplements e 2% de soro fetal bovino (SFB) (StemCell Technology), sem fatores de crescimento. As células são mantidas nesse meio de cultura em estufa (37 ºC, 5% CO₂, umidade > 95%) por 1 dia, quando inicia-se o tratamento com o meio de indução de diferenciação.

Cada poço recebe uma combinação específica de compostos, adicionados ao meio de cultivo descrito acima (volume final = 1 mL), que induzem diferenciação em determinado tipo celular, como segue adiante:

a) Diferenciação neuronal: adiciona-se ácido-retinóico all-trans (RA) (Sigma) e forscolina (Fsk) (Sigma) em concentração final de 0,1 mM e 5 mM, respectivamente.

b) Diferenciação em astrócito: adiciona-se 50 ng/mL de proteína morfogenética de osso-2 (BMP-2 - R&D System), 50 ng/mL de fator inibitório de leucemia (LIF - Sigma) e 1% de soro fetal bovino (StemCell Technology).

c) Diferenciação em oligodendrócito: adiciona-se 500 ng/mL de IGF-1 (insulin-like growth factor-1 - R&D System).

As células permanecem no meio indutor de diferenciação por 5 dias, que é substituído no terceiro dia.